蛋白从头测序（De Novo Sequencing）作为直接解析蛋白质氨基酸序列的技术，已成为非模式生物研究、抗体药物开发、蛋白突变与修饰鉴定等领域不可或缺的手段。其成功依赖于样品制备、质谱分析、数据解析及算法优化等多个环节的协同。本文将系统解析影响蛋白从头测序成败的核心因素，为科研人员提供全面的技术参考。

1、样品质量与制备

蛋白从头测序的第一步是确保样品的高质量和合适的制备方法。样品的复杂性、蛋白降解情况以及肽段的均一性都直接影响测序的准确性。

（1）样品纯度控制

高质量的样品是确保从头测序成功的前提。为避免蛋白降解，需在提取和处理过程中添加蛋白酶抑制剂，低温操作，并减少样品储存时间。为去除盐类、去污剂、核酸等干扰成分，应采用超滤、透析、凝胶过滤等纯化方法，提升质谱数据的质量。

（2）蛋白酶切割策略

采用多种蛋白酶组合酶切（如胰蛋白酶、Glu-C、Asp-N、Lys-C），可获得不同酶解位点的肽段，提高序列覆盖度。对于难解析区域，适当引入非特异性蛋白酶有助于获得更多碎片信息，但需注意数据复杂度的增加。

（3）低丰度蛋白富集

在复杂样品（如血浆、组织裂解液）中，为提升目标蛋白检测灵敏度，可通过去除高丰度蛋白或采用免疫亲和纯化、柱层析等方法进行选择性富集，增强低丰度蛋白的检测信号。

2、质谱分析优化

高分辨率和高灵敏度的质谱仪（MS）是成功从头测序的基础，关键在于适当的碎裂模式、仪器分辨率和数据采集策略。

（1）高分辨率质谱仪的选择

蛋白从头测序依赖高分辨率串联质谱（MS/MS），其中Orbitrap和FT-ICR MS由于其优越的质量分辨率（>100,000）和准确度（ppm级），成为首选。TOF（Time-of-Flight）与Q-TOF仪器也常用于从头测序，具有较高的检测速度和较宽的m/z覆盖范围。

（2）碎裂模式的优化

不同的质谱碎裂模式对肽段的解析能力不同，常见的碎裂方法包括：

• 碰撞诱导解离（CID）：主要产生b离子和y离子，适用于较短肽段，但对翻译后修饰（PTMs）敏感度较低。
• 高能碰撞解离（HCD）：生成更完整的b、y离子序列，同时能保持翻译后修饰信息。
• 电子转移解离（ETD）：适用于大分子和高度修饰的肽段，能够保留翻译后修饰信息（如磷酸化、糖基化）。

（3）数据采集策略

* 数据依赖采集（DDA）：选择信号最强的前体离子进行碎裂，适用于高丰度蛋白。

• 数据非依赖采集（DIA）：全扫描所有肽段，适用于低丰度蛋白的从头测序。
• 目标式数据采集（PRM、SRM）：用于特定蛋白的深度解析，减少背景干扰。

3、数据解析与算法优化

（1）离子匹配和谱图解读

通过b/y离子系列的完整性 评估肽段的可解析性，若某些氨基酸未能检测到相应的离子峰，可能会导致序列拼接错误。质量误差控制：采用高分辨率MS数据（如Orbitrap）减少误差围，确保匹配的精确性。

（2）算法优化

目前，蛋白从头测序的计算方法包括：

• 谱图拼接法（Spectrum Graph Approach）：构建碎裂离子之间的连接关系，推导出肽序列。
• 打分模型（Scoring Functions）：利用统计学模型计算最优序列匹配结果，如pNovo、PEAKS等软件采用Bayesian模型优化匹配概率。
• 机器学习与深度学习：近年来，人工智能（AI）已逐步应用于从头测序，如DeepNovo等工具利用神经网络进行序列预测，提高复杂谱图的解析能力。

（3）翻译后修饰（PTMs）解析

修饰后的氨基酸往往导致肽段的m/z发生漂移，需在算法中考虑修饰引起的质量偏移，如磷酸化（+79.97 Da）、乙酰化（+42.01 Da）。ETD碎裂常用于识别翻译后修饰，结合高分辨率质谱数据，提高修饰位点的定位精度。

4、结果验证与数据整合

（1）序列拼接

不同的肽段组合可能会影响最终的蛋白序列，实验通常结合不同蛋白酶消化的结果进行比对，以获得更完整的序列。

（2）数据库比对

虽然从头测序的目标是不依赖数据库，但仍然可以利用现有蛋白数据库（如Uniprot）进行交叉验证，以确保准确性。

（3）功能验证

对测序得到的蛋白进行生物学实验验证（如蛋白质印迹Western Blot、ELISA、结构建模），确保解析的序列与其生物功能一致。

随着高分辨率质谱、深度学习算法以及翻译后修饰解析方法的不断进步，蛋白从头测序的准确性和效率将持续提升。百泰派克生物科技为广大客户提供蛋白从头测序服务。我们的“一站式”服务能为您节省时间和精力，帮助您更高效地开展相关研究。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

>>点击了解更多优质服务项目